產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
快速抗體純化磁珠
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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EA101 |
BcMag ? 快速抗體純化試劑盒 |
2 ml （純化高達(dá)10mg IgG） |
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EA102 |
BcMag ? 快速抗體純化試劑盒 |
10 ml （純化高達(dá)50mg IgG） |
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運(yùn)輸條件: 常溫運(yùn)輸
儲(chǔ)存條件: 在4oC儲(chǔ)存試劑盒。
原理
可以使用以4-巰基-乙基吡啶為配體的疏水電荷誘導(dǎo)色譜法從各種生物物質(zhì)中分離抗體（圖1）。結(jié)合基于溫和的疏水結(jié)合方式，并且在接近生理的情況下完成，不需要使用鹽。當(dāng)pH降低時(shí)，配體和抗體在溫和的酸性環(huán)境（pH 4.0-4.5）下獲得凈正電荷。
與更傳統(tǒng)的抗體純化方法（如蛋白A或離子交換）相比，HCIC具有幾個(gè)工藝優(yōu)勢(shì)：
? 樣品制備時(shí)減少對(duì)樣品的損傷，因?yàn)?/span>磁珠可以在沒(méi)有離子強(qiáng)度或極端pH調(diào)節(jié)的情況下使用。
? 對(duì)樣品中目標(biāo)產(chǎn)物濃度低的現(xiàn)象不需要預(yù)濃縮，因?yàn)榧词?/span>原樣品稀釋至每毫升40ug抗體，也可以實(shí)現(xiàn)有效捕獲。
? 用稀釋緩沖液進(jìn)行溫和的pH控制洗脫可降低在較低pH下抗體聚集的可能性，并避免需要IgG脫鹽或滲濾。
磁珠產(chǎn)品與傳統(tǒng)色譜法如純化柱、瓊脂糖或非磁性樹脂相比具有顯著優(yōu)勢(shì)?；诖胖榈奶匦?span>可以在約20分鐘內(nèi)快速高產(chǎn)率處理96個(gè)樣品，不同IgG種類抗體純化產(chǎn)物獲得超過(guò)80％純度和超過(guò)90％回收率。當(dāng)使用基于色譜柱的技術(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，在科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室處理多個(gè)樣品時(shí)，可能需要大量的手動(dòng)移液操作。這種移液操作會(huì)造成實(shí)驗(yàn)和人之間目標(biāo)生物分子產(chǎn)量的差異。實(shí)驗(yàn)人員和學(xué)生可能需要大量的培訓(xùn)和實(shí)踐才能產(chǎn)生恒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。而且磁珠具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如它們易于使用，快速的實(shí)驗(yàn)方案，適用性以及高通量自動(dòng)化和小型化處理的便利性等。
工作流程（圖2）
使用色譜法分離復(fù)雜混合物中存在的抗體涉及結(jié)合珠子的抗體。結(jié)合后，洗滌磁珠以除去非抗體蛋白。最后，從磁珠上洗脫抗體。
功能和優(yōu)點(diǎn)
? 高效 - 回收率超過(guò)90％，純度超過(guò)85％。
? 快速純化 - 一步法手動(dòng)或一步法高通量操作。
? 便捷 -無(wú)需使用純化柱、過(guò)濾器，且不需要繁瑣的移液或離心操作。
? 不含胺基緩沖液 - 無(wú)需進(jìn)行去除或中和操作。
? 結(jié)合力強(qiáng) - 適用于對(duì)蛋白A或蛋白G結(jié)合能力較差的IgG亞類。
? 溫和 - 無(wú)需苛刻的抗體洗脫條件，有助于保持IgG的活性。
? 可再生 - 磁珠可重復(fù)使用，可進(jìn)行多達(dá)3次純化。
操作協(xié)議
提示：
? 以下方案是從血清中純化抗體的例子。
? 磁珠和樣品體積可以合理放大（或縮?。?/span>
緩沖液：
? 2x結(jié)合/洗滌緩沖液：25 mM磷酸鈉，pH 8.5
? 洗脫緩沖液：20 mM乙酸鈉，pH 4.0100 mM NaCl
? 再生緩沖液：35 mM磷酸鈉；30%正丙醇，pH 8.5
儀器要求
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Item |
Source |
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磁力分離器
**根據(jù)樣品體積，用戶可以選擇以下磁力分離器之一 |
l BcMag? separator-2 適用于兩個(gè)單獨(dú)的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag? separator-6 適用于六個(gè)單獨(dú)的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag? separator-24 適用于24個(gè)單獨(dú)的1.5-2.0 ml離心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag? separator-50 適用于1個(gè)單獨(dú)的50毫升離心管，1個(gè)單獨(dú)的15毫升離心管, 以及4個(gè) 1.5毫升 離心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分離器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分離器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可調(diào)單通道和多通道移液器 |
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擺斗離心機(jī) |
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如果使用96孔PCR板/管，則需要添加項(xiàng)目 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號(hào)的渦懸混合器。但是，時(shí)間和速度應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，并且混合器應(yīng)滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉(zhuǎn)速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf? MixMate? |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24?×?1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 離心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，確保PCR管或PCR板錐形部分底部的井徑必須≥2.5毫米。 |
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如果使用96孔微孔板需要添加的設(shè)備 |
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Fisher Scientific? Microplate Advanced Vortex Mixers |
Fisher, Cat#:02-216-101 |
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OHAUS Microplate Vortex Mixers |
OHAUS, Cat#:30392160 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號(hào)的渦懸混合器。但是，時(shí)間和速度應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，并且混合器應(yīng)滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉(zhuǎn)速 ≥800 rpm |
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平底透明的非結(jié)合型分析微孔板 |
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實(shí)驗(yàn)步驟
重要提示：
? 以下方案針對(duì)3μl血清樣品的高效純化進(jìn)行的優(yōu)化。如果進(jìn)行其他反應(yīng)，則可能需要進(jìn)行程序優(yōu)化。
? 在使用前，搖晃或渦旋混合試劑瓶，完全重懸磁珠。
? 不要讓磁珠靜置超過(guò)兩分鐘。
A. 樣品制備
1. 用等體積的2x結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋全血清并充分混合。
B. 磁珠制備
1. 搖動(dòng)試劑瓶以完全重懸磁珠。
2. 將所需量的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中（注意：1ml的 BcMag? 快速抗體純化磁珠，建議用于0.5-1毫升全血清純化使用?？梢韵鄳?yīng)地縮放體積。血清中的IgG水平通常為10-15mg/ml）。將試管放在磁性支架上1-3分鐘，直到上清液變清。在管保持在支架上的同時(shí)除去上清液。
3. 取出試管，用10倍磁珠體積的1x結(jié)合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
C. 樣品結(jié)合
1. 將步驟B.4中洗滌過(guò)的磁珠添加到步驟A1中稀釋的樣品中。將磁珠完全重懸，并在室溫下放置10-30分鐘，并進(jìn)行顛倒旋轉(zhuǎn)。
2. 將試管放在磁性支架上1-3分鐘。在管保持在支架上的同時(shí)除去上清液。從支架上取下試管，用10倍磁珠體積的1x結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。
3. 重復(fù)步驟3五次
D. IgG洗脫
1. 從支架上取下試管，用10倍磁珠體積的洗脫緩沖液重懸磁珠以洗脫IgG。將試管放在磁性支架上1-3分鐘。在管保持在支架上的同時(shí)移走上清液。
小型高通量?jī)艋?/span>
1. 將50μl磁珠（步驟B4）轉(zhuǎn)移到96孔PCR板或96孔微孔板或0.2ml PCR管的新孔中，并將A1中稀釋的血清吸取20μl加入。
2. 通過(guò)緩慢上下移液25次（一分鐘）或通過(guò)渦旋混合器以2000 rpm混合5分鐘，將磁珠與樣品混合。
3. 將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。
4. 丟棄上清液，并使用磁力架用100μl 1x結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次。
5. 加入50μl洗脫緩沖液，通過(guò)緩慢上下移液25次（一分鐘）或以2000 rpm的速度渦旋混合器5分鐘來(lái)洗脫抗體。
6. 將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。
7. 將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的板/管中，同時(shí)樣品板保持在磁分離板上。該樣本已準(zhǔn)備好用于下游應(yīng)用。
附加信息：
磁珠再生
1. 如果必須再生磁珠，則添加10ml 35 mM磷酸鈉；30%正丙醇，pH 8.5緩沖液，用于1 ml磁珠再生，并通過(guò)緩慢上下移液25次將磁珠與樣品混合。將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。丟棄上清液。
2. 重復(fù)步驟1五次。
3. 用10倍磁珠體積的1x結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次
4. 將磁珠重懸于1x結(jié)合/洗滌緩沖液中，并保存在4°C。磁珠可以再生三次而不會(huì)失去實(shí)質(zhì)性的選擇性。
故障排除
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問(wèn)題 |
可能的原因 |
建議 |
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純化抗體的產(chǎn)量太低或檢測(cè)不到 |
沒(méi)有抗體的樣品 |
? 通過(guò)使用其他方法（例如ELISA或同種型試劑盒）確保樣品含有IgG。 |
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感興趣的抗體不與磁珠結(jié)合 |
? 確保樣品的pH值在8.5之間。 |
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觀察染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上存在多條帶 |
磁珠和樣品的比例沒(méi)有得到優(yōu)化。 |
? 用1x biding/wash緩沖液透析樣品。 ? 優(yōu)化珠子和樣品的比例 |
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純化了大量抗體。然而，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感興趣的抗體。 |
感興趣的抗體濃度低。 |
? 利用活性親和磁珠和特異性抗原純化抗體。 |
