產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒（II）
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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FD107 |
BcMag? 糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒（II） |
一個 |
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存儲條件 |
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2.5μm BcMag? 可分離式酰肼基磁珠 |
4℃ |
150mg |
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10x結(jié)合緩沖器 |
4℃ |
10ml |
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氧化劑（NaIO4） |
4℃ |
100mg |
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5 x洗滌緩沖液 |
4℃ |
15ml |
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10xPBS |
4℃ |
5.0ml |
儲存：收到產(chǎn)品時，將試劑盒儲存在4oC。
BcMag ? 糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒能夠運用蛋白質(zhì)上羰基酮或醛的相似基團在生物化合物中形成固定位點。這些位點使共價結(jié)合位點遠離活性中心或結(jié)合區(qū)域。糖復(fù)合物如糖蛋白和糖脂在相鄰碳原子上含有具有羥基的糖殘基。用高碘酸鈉氧化這些順式二醇就會產(chǎn)生可用作共價固定位點的醛基。
本試劑盒使用酰肼基活化磁珠和特定催化劑產(chǎn)生與糖蛋白和抗體的親和力。單克隆抗體和糖基化蛋白可以用高碘酸鹽氧化的碳水化合物基團固定，以產(chǎn)生可重復(fù)使用的親和基質(zhì)。這種使用酰肼基團化學固定的抗體，具有抗原結(jié)合位不會受到阻礙的有點，和對抗體具有優(yōu)良的純化能力。在含有催化劑的，簡單的非胺緩沖液中，完全偶聯(lián)只需要2至4小時?？贵w和常見糖蛋白的偶聯(lián)效率通常大于85%，每毫克的酰肼基磁珠可以固定15μg至20μg蛋白。用穩(wěn)定的糖蛋白或抗體制備的基質(zhì)可以再生并重復(fù)使用至少五次，而不會明顯喪失結(jié)合能力。
BcMag ? 酰肼基磁珠是在表面連接有高密度酰肼官能團的均勻磁珠。酰肼基磁珠可通過低聚糖部分，定點固定含醛或酮的配體，例如抗體、凝集素、糖蛋白、糖和碳水化合物等。而且，酰肼基僅在Fc區(qū)域或附近結(jié)合，不會對抗體功能產(chǎn)生不利影響。以這種選擇性地與靶向分子Fc部分的重鏈結(jié)合的方式偶聯(lián)抗體，有助于Fv區(qū)域末端盡可能最好地保存抗原結(jié)合活性。在pH 5至7條件下，酰肼基的載體和化合物將與氧化碳水化合物的羰基結(jié)合，從而產(chǎn)生腙鍵（圖1）。酰肼基磁珠珠適合結(jié)合較大的糖蛋白和糖脂，碳水化合物或其他配體。它的親水性表面基團保證了磁珠在實驗過程中，具有極低的非特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。
工作流程
本款磁珠可以完美地作為親和樹脂進行親和純化，將分子、細胞和部分細胞提取物進行提煉純化。在與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標分子的樣品中，然后混合、孵育、洗滌和洗脫目標分子。
功能和優(yōu)點。
· 特異性的固定反應(yīng)------酰肼基活化磁珠僅會與，已被高碘酸鹽（例如唾液酸）輕度氧化的，含有糖基的純糖蛋白結(jié)合。
· 穩(wěn)定的共價鍵，低水平的配體泄漏
· 維持抗體功能-----通過Fc區(qū)固定IgG，保留兩個抗原結(jié)合位點，均可用于靶目標的捕獲。
· 極低的非特異性結(jié)合率
· 極高的固定容量：15-20μg抗體/mg磁珠。
操作協(xié)議
提示
l 強烈建議在實驗過程中進行滴定優(yōu)化，以確定每個實驗中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。
l 應(yīng)避免使用含有伯胺基團或糖類的Tris或其他緩沖液，因為它們會與預(yù)期的
偶聯(lián)反應(yīng)物競爭結(jié)合磁珠。
所需耗材
1.磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：
BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);
BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);
BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);
BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);
BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).
2.Coupling Buffer: 0.1 M 磷酸鈉, pH 7.0
3.氧化劑: Sodium meta-Periodate (NaIO4) (Sigma, Cat# S1878)
4.Washing Buffer: 1M NaCl
5.PBS
配體的偶聯(lián)反應(yīng)
A. 磁珠的準備
1.稱取30 mg磁珠，并將其加入到1.5 ml離心管中。
2.加入1毫升coupling buffer，并通過渦旋或移液器吹吸方式將磁珠充分懸浮。
3.將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。
4.將清洗的磁珠準備進行耦合反應(yīng)。
B.糖蛋白或其他配體的氧化
注意：該反應(yīng)對光敏感，應(yīng)在黑暗中進行。
1.將0.5-10 mg糖蛋白或者其他配體溶解或稀釋于1 ml Coupling Buffer中。（注：如果蛋白質(zhì)或者其他配體已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，則通過透析脫鹽柱進行緩沖液交換。）
2.將蛋白質(zhì)其他配體溶液添加到含有2 mg高碘酸鈉（最終濃度為10 mM）的棕色小瓶中。輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解氧化劑。
3.在室溫下，將樣品在黑暗中緩慢旋轉(zhuǎn)孵育45分鐘。
C.偶聯(lián)反應(yīng)
1. 將氧化后的蛋白質(zhì)或其他配體溶液添加到步驟A4制備的磁珠中，并通過旋轉(zhuǎn)或移液器吹吸方式充分混合。
提示：偶聯(lián)效率取決于目標糖蛋白或其他配體的結(jié)構(gòu)和大小。用戶應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗優(yōu)化蛋白質(zhì)與磁珠的比例。
2. 在室溫下，在黑暗中孵育反應(yīng)過夜，過程中保持充分混合
3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。取下試管，用5ml的Coupling buffer通過渦懸或者吹吸重新懸浮磁珠。
4. 重復(fù)步驟3三次。
5. 用含有0.1%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，在4°C下儲存，直至使用。不要冷凍保存。
D、常見親和純化過程
提示：
l 該方案是一個通用的親和純化發(fā)法。因為沒有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計一個通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個用戶必須確定純化單個目標蛋白的最佳工作條件。
l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。
l 強烈建議根據(jù)粗樣品中目標蛋白質(zhì)的含量，進行滴定，以優(yōu)化每個單獨實驗中使用的磁珠數(shù)量。使用過多的磁珠
將導(dǎo)致較高的背景，而使用過少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通?？膳c1-20μg靶蛋白結(jié)合。
1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。
2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30
秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。
3.重復(fù)步驟2 兩次。
4. 向含有目標蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小時（溫度越低，培養(yǎng)時間越長）。
提示：強烈建議進行滴定實驗以優(yōu)化培養(yǎng)時間。因為孵化的時間太長可能會導(dǎo)致很高的背景。
5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。
提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。
6. 通過適當?shù)姆椒?，如?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標蛋白。
7.切斷二硫鍵
提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶應(yīng)確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。
1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。
a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時或
者過夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。
b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時或者過夜孵
育，或者在98℃條件下5分鐘。
