產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
低表達(dá)量His標(biāo)簽蛋白質(zhì)純化試劑盒。
|
貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
|
|
|
MHQ101 |
BcMag公司? 低表達(dá)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 |
5毫升 |
|
|
|
MHQ102 |
BcMag公司? 低表達(dá)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 |
10毫升 |
|
|
產(chǎn)品屬性 |
|
|
組成 |
表面連接有 Ni2+的磁珠 |
|
磁力大小 |
~60 EMU/g |
|
磁化類型 |
超順磁性 |
|
穩(wěn)定性 |
適用于pH 4-11,100%乙醇，100%甲醇，8M尿素，6M鹽酸胍， 20 mM DTT, 20mM EDTA |
|
濃度 |
100 mg/ml (1% NiSO4.6H2O) |
|
結(jié)合能力 |
>2mg His-標(biāo)簽 GFP /ml 磁珠 |
|
儲(chǔ)存 |
儲(chǔ)存在 4°C |
運(yùn)輸條件: 常溫運(yùn)輸
儲(chǔ)存條件: 在4oC儲(chǔ)存試劑盒。
BcMag ? 低表達(dá)量His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)純化試劑盒使用還原試劑兼容的磁珠純化His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能存在有非特異性結(jié)合問(wèn)題，例如低表達(dá)蛋白質(zhì)或靶蛋白與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合（圖1）。磁珠是使用納米級(jí)超順磁性氧化鐵作為核心制造的，并完全由高純度二氧化硅外殼包裹，確保氧化鐵沒(méi)有浸出問(wèn)題。我們專有的螯合劑固定在其表面上，并與Ni2+離子牢固結(jié)合，從而對(duì)還原劑產(chǎn)生高抗性。由于二氧化硅材料產(chǎn)生的側(cè)鏈比其他固體基質(zhì)如瓊脂糖要少很多，因此純惰性二氧化硅產(chǎn)生的非特異性結(jié)合較少。此外，磁珠結(jié)合了BcMag ? 低表達(dá)His標(biāo)記的蛋白質(zhì)純化試劑盒的所有優(yōu)點(diǎn)（低成本，簡(jiǎn)單，高特異性和容量）和磁性，可進(jìn)行有效的手動(dòng)或自動(dòng)快速高通量純化。
工作流程（圖2）
用磁珠進(jìn)行純化很簡(jiǎn)單（圖2）。將磁珠與樣品混合，并連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育足夠的時(shí)間。在混合過(guò)程中，磁珠保持懸浮在樣品溶液中，使目標(biāo)分子與固定化配體相互作用。孵育后，收集磁珠并使用磁力架將其與樣品分離。然后用咪唑洗脫超純His標(biāo)記的重組蛋白。
優(yōu)勢(shì)及特點(diǎn)
l 磁珠表現(xiàn)出比多孔載體更少的非特異性結(jié)合率。
l 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，最少的配體泄漏
l 在含有高達(dá)20mM EDTA和20mM還原試劑的情況下，磁珠不會(huì)發(fā)生鎳離子浸出現(xiàn)象。
l 與細(xì)胞培養(yǎng)基中過(guò)量表達(dá)、或分泌蛋白的純化兼容。
l 極高的蛋白純度
l 性價(jià)比高：無(wú)需使用純化柱、過(guò)濾器、有機(jī)試劑或進(jìn)行重復(fù)移液。
l 高通量：與許多不同的自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)兼容。
產(chǎn)品應(yīng)用
l 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能
l X射線晶體學(xué)的重組蛋白的制備
l 是研究蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)或DNA相互作用的理想選擇材料
l 在免疫研究中，提高抗體與對(duì)應(yīng)蛋白的結(jié)合和能力
l 即使使用粗細(xì)胞裂解液，也能有效篩選出表達(dá)的蛋白質(zhì)
l His標(biāo)簽蛋白的微量純化
背景信息
背景信息
多聚組氨酸標(biāo)簽，也稱為6xHis標(biāo)簽，和His標(biāo)簽，是從各種表達(dá)系統(tǒng)（包括細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)）中純化重組蛋白的通用工具。該標(biāo)簽是位于重組蛋白的N或C末端的包含六個(gè)或更多個(gè)連續(xù)組氨酸的殘基。由于這個(gè)氨基酸鏈體積非常小，His標(biāo)簽具有幾個(gè)獨(dú)特的特性，包括較少的免疫原性、親水性以及可在天然和變性條件下都可發(fā)揮作用的用途廣泛性。此外，不需要從重組蛋白上切割標(biāo)簽，因?yàn)樗粫?huì)干擾其融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。His標(biāo)簽的純化原理基于固定化金屬離子親和層析（IMAC）。
固定化金屬離子親和層析（IMAC）是一種快速的親和純化層析技術(shù)，是基于攜帶his標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)對(duì)Ni2+或Co2+的親和力從而達(dá)到分離目的，而Ni2+或Co2+則被結(jié)合固定到固相基質(zhì)表面，例如珠狀瓊脂糖或純化柱。在pH 7-8時(shí)，His標(biāo)簽蛋白將與Ni2+或Co2+結(jié)合。His標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)受到各種自變量的影響，如pH、溫度、鹽類型、鹽濃度、固定化的金屬和配體密度以及蛋白質(zhì)大小?？赏ㄟ^(guò)降低pH梯度、增加咪唑濃度或在緩沖液中加入EDTA螯合劑來(lái)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。該技術(shù)是快速、直接捕獲和純化帶標(biāo)簽重組蛋白的，高性價(jià)比的理想工具。
非特異性結(jié)合是從各種表達(dá)系統(tǒng)中純化his標(biāo)簽蛋白的潛在問(wèn)題，尤其是從低表達(dá)的重組his標(biāo)簽蛋白或與其他細(xì)胞蛋白相互作用的高表達(dá)蛋白中純化his標(biāo)簽蛋白。許多因素可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合。其中，低表達(dá)蛋白或與內(nèi)源蛋白結(jié)合的標(biāo)記蛋白可能導(dǎo)致嚴(yán)重的非特異性結(jié)合。His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)與IMAC的金屬離子的結(jié)合取決于電荷。當(dāng)樹(shù)脂的his標(biāo)簽結(jié)合位點(diǎn)由于其低豐度而僅部分結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合。其余的結(jié)合位點(diǎn)與其他帶輕微電荷的蛋白質(zhì)（如富含組氨酸的蛋白質(zhì)）發(fā)生非特異性相互作用，導(dǎo)致純化出的蛋白出現(xiàn)雜質(zhì)。許多證據(jù)表明，在結(jié)合和洗滌緩沖液中還原試劑和非離子洗滌劑可以顯著降低高度非特異性結(jié)合，并獲得更純凈的蛋白質(zhì)。IMAC應(yīng)用中最常用的螯合劑是亞氨基二乙酸酯（IDA）或氮基三乙酸（NTA）。這些螯合劑不能與還原劑如DTT（二硫蘇糖醇），β-me（β-巰基乙醇）和TCEP（三（2-羧乙基）膦）一起使用，因?yàn)檫€原劑可以從這些樹(shù)脂中剝離金屬，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)合能力的快速喪失。
此外，這些螯合劑主要固定在傳統(tǒng)的親和色譜基質(zhì)上，如瓊脂糖樹(shù)脂或色譜柱。這些固體基質(zhì)使純化過(guò)程繁瑣，耗時(shí)，無(wú)法處理非常微小的樣品，并且難以適應(yīng)自動(dòng)化系統(tǒng)。Bioclone推出了一種功能強(qiáng)大的基于磁珠的IMAC系統(tǒng)來(lái)解決這些問(wèn)題。
參考文獻(xiàn)
1.Jansen, J-C. (Editor). (2011). Protein Purification: Principles, High-Resolution Methods, and Applications. 3rd edition. Volume 151 of Methods of Biochemical Analysis. John Wiley & Sons, Hoboken, NJ
2.Bornhorst, J.A. and Falke, J.J. (2000). Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods Enzymol. 326: 245-254.
3.Spriestersbach A, Kubicek J, Sch?fer F, Block H, Maertens B. Purification of His-Tagged Proteins. Methods Enzymol. 2015;559:1-15. doi: 10.1016/bs.mie.2014.11.003. Epub 2015 May 4. PMID: 26096499.
4.Zhang C, Fredericks D, Longford D, Campi E, Sawford T, Hearn MT. Changed loading conditions and lysate composition improve the purity of tagged recombinant proteins with tacn-based IMAC adsorbents. Biotechnol J. 2015 Mar;10(3):480-9. doi: 10.1002/biot.201400463. Epub 2014 Oct 31. PMID: 25303209.
5.Pina AS, et al. (2014) Affinity tags in protein purification and peptide enrichment: An overview. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1129: 147-168.
6.Young CL, et al. (2012) Recombinant protein expression and purification: A comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnol J 7(5): 620-634.
