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可分離式甲苯磺酰基磁珠

BcMag^TM可分離式甲苯磺?；罨胖?/span>是表面覆蓋有高密度甲苯磺?；倌軋F的二氧化硅基質(zhì)的磁珠。甲苯磺?；罨胖榭梢栽诓灰肴魏坞姾傻那闆r下，在水或有機溶劑（30%DMF）中有效地共價結(jié)合含有伯胺基的配體。因為活性醛基基團通過內(nèi)置的可切割二硫鍵連接物（圖1）與磁珠連接，因此，可用還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）從磁珠上切割并分離出目標(biāo)分子-配體的復(fù)合物。可分離式甲苯磺酰基磁珠是結(jié)合大分子蛋白和多肽的理想選擇。

甲苯磺酰基活化磁珠是將抗體，多肽，完整蛋白質(zhì)和功能酶共價連接到磁珠表面的理想選擇。固定化的磁珠由于其低背景和抗體與磁珠表面的共價結(jié)合，而廣泛用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的免疫沉淀。

甲苯磺?；罨?/span>磁珠偶聯(lián)反應(yīng)在37℃下進行，pH范圍在偏堿性環(huán)境。我們建議在pH 8.5-9.5下偶聯(lián)，但與高pH不穩(wěn)定配體的偶聯(lián)可以在pH 7.4的替代緩沖液中進行。

產(chǎn)品獨特的干燥狀態(tài)避免了丙酮溶劑儲存的麻煩，或液體去除和處理的需要。此外，由于干基質(zhì)在膨脹時濃縮樣品，減少了起始材料的體積，并且會提高配體固定化的效率，因此它非常適合與濃度較低樣品進行偶聯(lián)反應(yīng)。

工作流程

本磁珠作為固體載體可以完美地用于各種親和純化，將分子，細(xì)胞和部分細(xì)胞進行純化。只需要與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脫目標(biāo)分子（圖2）

特點和優(yōu)勢：

l 預(yù)活化，即用型磁珠

l 含有一個可切割的內(nèi)置二硫鍵，可將配體-目標(biāo)分子復(fù)合物從磁珠中分離出來。

l 便于使用

l 結(jié)和后表面不會帶電荷

l 穩(wěn)定的共價鍵，低水平的配體泄漏 

l 可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)           

l 極低的非特異性結(jié)合率 

l 可固定1-10mg蛋白或0.1-1mg多肽/ml的磁珠 

l 用途：用于純化抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA;細(xì)胞篩選、免疫沉淀

操作過程

提示：

l 強烈建議在實驗過程中進行滴定優(yōu)化，以確定每個實驗中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。

l 避免使用含有還原劑、tris或其他含有伯胺或其他親核類試劑的緩沖液，因為它們會破壞二硫鍵連接物或與預(yù)期的偶聯(lián)反應(yīng)競爭。但wash buffers和 storage buffers 可含有氨基或羧基成分。

所需耗材

1.磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).

2.Coupling Buffer: 0.1 M磷酸鈉緩沖液，pH 7.4

提示：

l coupling buffers應(yīng)具有最小的離子強度，且不應(yīng)含有任何具有氨基（如Tris）的成分。但wash buffers 或者storage buffers可含有氨基或羧基。

l 水不溶性配體可以在含有30%有機溶劑（30%DMF）的coupling buffers中結(jié)合。

3. Blocking Buffer: PBS pH 7.4 含有 0.5% (w/v) BSA

4. Washing buffer: PBS pH 7.4含有 0.1% (w/v) BSA

A.磁珠的準(zhǔn)備

1.用100%異丙醇制備3%的磁珠（30 mg/ml），并充分混合。

提示：將未使用的磁珠可以在異丙醇溶液中，儲存在4℃。可保存一年時間。

2.將100μl（3mg）的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。

3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過渦旋30秒重新懸浮磁珠。

4.重復(fù)步驟3 兩次。

5.去除上清液，將清洗的磁珠準(zhǔn)備進行耦合反應(yīng)。

注：使用coupling buffer重新水化后，由于官能團的穩(wěn)定性，應(yīng)盡快使用磁珠。

B.蛋白質(zhì)結(jié)合

1.用coupling buffer制備100μl蛋白質(zhì)溶液（0.5-1mg/ml）或多肽溶液（200μmol/ml）。

提示：偶合效率因配體而異。用戶可應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗優(yōu)化配體的濃度。

2. 將蛋白質(zhì)或者多肽溶液與上述清洗過的磁珠混合，通過渦旋或者吹吸的方式。

3. 孵育反應(yīng)，在20-25℃溫度下偶合至少需要24-48小時。在4℃下耦合時，培養(yǎng)時間

應(yīng)至少延長至48-72小時。

4. 用1ml的washing buffer將磁珠洗滌3次。

5. 向磁珠中添加1ml的blocking buffer，并在室溫下孵育1小時或4℃過夜。

6. 用1 ml的PBS洗滌磁珠4-6次。

7. 用含有0.1%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，在

4°C下儲存，直至使用。不要冷凍保存。

C．常見親和純化過程

提示：

l 該方案是一個通用的親和純化發(fā)法。因為沒有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計一個通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個用戶必須確定純化單個目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。

l 強烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進行滴定，以優(yōu)化每個單獨實驗   

中使用的磁珠數(shù)量。使用過多的磁珠將導(dǎo)致較高的背景，而使用過少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通?？膳c1-20μg靶蛋白結(jié)合。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時，去除上清液。

2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30

秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全

沉淀時，去除上清液。

3.重復(fù)步驟2 兩次。

4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小

時（溫度越低，培養(yǎng)時間越長）。

提示：強烈建議進行滴定實驗以優(yōu)化培養(yǎng)時間。因為孵化的時間太長可能會導(dǎo)致很高的背景。

5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

    提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。

6. 通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎ绲?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。

7.切斷二硫鍵

提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶應(yīng)確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時或

者過夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時或者過夜孵

育，或者在98℃條件下5分鐘。