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糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒（II）

運(yùn)輸條件：常溫環(huán)境

儲(chǔ)存：收到產(chǎn)品時(shí)，將試劑盒儲(chǔ)存在4oC。

BcMag ? 糖蛋白和抗體結(jié)合試劑盒能夠運(yùn)用蛋白質(zhì)上羰基酮或醛的相似基團(tuán)在生物化合物中形成固定位點(diǎn)。這些位點(diǎn)使共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離活性中心或結(jié)合區(qū)域。糖復(fù)合物如糖蛋白和糖脂在相鄰碳原子上含有具有羥基的糖殘基。用高碘酸鈉氧化這些順式二醇就會(huì)產(chǎn)生可用作共價(jià)固定位點(diǎn)的醛基。

本試劑盒使用酰肼基活化磁珠和特定催化劑產(chǎn)生與糖蛋白和抗體的親和力。單克隆抗體和糖基化蛋白可以用高碘酸鹽氧化的碳水化合物基團(tuán)固定，以產(chǎn)生可重復(fù)使用的親和基質(zhì)。這種使用酰肼基團(tuán)化學(xué)固定的抗體，具有抗原結(jié)合位不會(huì)受到阻礙的有點(diǎn)，和對(duì)抗體具有優(yōu)良的純化能力。在含有催化劑的，簡(jiǎn)單的非胺緩沖液中，完全偶聯(lián)只需要2至4小時(shí)?？贵w和常見(jiàn)糖蛋白的偶聯(lián)效率通常大于85%，每毫克的酰肼基磁珠可以固定15μg至20μg蛋白。用穩(wěn)定的糖蛋白或抗體制備的基質(zhì)可以再生并重復(fù)使用至少五次，而不會(huì)明顯喪失結(jié)合能力。

BcMag ? 酰肼基磁珠是在表面連接有高密度酰肼官能團(tuán)的均勻磁珠。酰肼基磁珠可通過(guò)低聚糖部分，定點(diǎn)固定含醛或酮的配體，例如抗體、凝集素、糖蛋白、糖和碳水化合物等。而且，酰肼基僅在Fc區(qū)域或附近結(jié)合，不會(huì)對(duì)抗體功能產(chǎn)生不利影響。以這種選擇性地與靶向分子Fc部分的重鏈結(jié)合的方式偶聯(lián)抗體，有助于Fv區(qū)域末端盡可能最好地保存抗原結(jié)合活性。在pH 5至7條件下，酰肼基的載體和化合物將與氧化碳水化合物的羰基結(jié)合，從而產(chǎn)生腙鍵（圖1）。酰肼基磁珠珠適合結(jié)合較大的糖蛋白和糖脂，碳水化合物或其他配體。它的親水性表面基團(tuán)保證了磁珠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，具有極低的非特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。

工作流程

本款磁珠可以完美地作為親和樹(shù)脂進(jìn)行親和純化，將分子、細(xì)胞和部分細(xì)胞提取物進(jìn)行提煉純化。在與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的樣品中，然后混合、孵育、洗滌和洗脫目標(biāo)分子。

功能和優(yōu)點(diǎn)。

· 特異性的固定反應(yīng)------酰肼基活化磁珠僅會(huì)與，已被高碘酸鹽（例如唾液酸）輕度氧化的，含有糖基的純糖蛋白結(jié)合。

· 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，低水平的配體泄漏

· 維持抗體功能-----通過(guò)Fc區(qū)固定IgG，保留兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，均可用于靶目標(biāo)的捕獲。

· 極低的非特異性結(jié)合率 

· 極高的固定容量：15-20μg抗體/mg磁珠。

操作協(xié)議

提示

l 強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行滴定優(yōu)化，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。

l  應(yīng)避免使用含有伯胺基團(tuán)或糖類的Tris或其他緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與預(yù)期的 

偶聯(lián)反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠。

所需耗材

1.磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號(hào)的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個(gè)單獨(dú)的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

BcMag? separator-50可以容納一個(gè)單獨(dú)的50 ml離心管，一個(gè)15ml的離心管，以及四個(gè)1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).

2.Coupling Buffer: 0.1 M 磷酸鈉, pH 7.0

3.氧化劑: Sodium meta-Periodate (NaIO4) (Sigma, Cat# S1878)

4.Washing Buffer: 1M NaCl

5.PBS

配體的偶聯(lián)反應(yīng)

A. 磁珠的準(zhǔn)備

1.稱取30 mg磁珠，并將其加入到1.5 ml離心管中。

2.加入1毫升coupling buffer，并通過(guò)渦旋或移液器吹吸方式將磁珠充分懸浮。

3.將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。

4.將清洗的磁珠準(zhǔn)備進(jìn)行耦合反應(yīng)。

B.糖蛋白或其他配體的氧化

注意：該反應(yīng)對(duì)光敏感，應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。

1.將0.5-10 mg糖蛋白或者其他配體溶解或稀釋于1 ml Coupling Buffer中。（注：如果蛋白質(zhì)或者其他配體已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，則通過(guò)透析脫鹽柱進(jìn)行緩沖液交換。）

2.將蛋白質(zhì)其他配體溶液添加到含有2 mg高碘酸鈉（最終濃度為10 mM）的棕色小瓶中。輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解氧化劑。

3.在室溫下，將樣品在黑暗中緩慢旋轉(zhuǎn)孵育45分鐘。

C.偶聯(lián)反應(yīng)

1. 將氧化后的蛋白質(zhì)或其他配體溶液添加到步驟A4制備的磁珠中，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)或移液器吹吸方式充分混合。

提示：偶聯(lián)效率取決于目標(biāo)糖蛋白或其他配體的結(jié)構(gòu)和大小。用戶應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化蛋白質(zhì)與磁珠的比例。

2. 在室溫下，在黑暗中孵育反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)程中保持充分混合

3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。取下試管，用5ml的Coupling buffer通過(guò)渦懸或者吹吸重新懸浮磁珠。

4. 重復(fù)步驟3三次。

5. 用含有0.1%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，在4°C下儲(chǔ)存，直至使用。不要冷凍保存。

D、常見(jiàn)親和純化過(guò)程

提示：

l 該方案是一個(gè)通用的親和純化發(fā)法。因?yàn)闆](méi)有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)一個(gè)通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶必須確定純化單個(gè)目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。

l 強(qiáng)烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)行滴定，以優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中使用的磁珠數(shù)量。使用過(guò)多的磁珠  

將導(dǎo)致較高的背景，而使用過(guò)少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通?？膳c1-20μg靶蛋白結(jié)合。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。

2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過(guò)震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30

秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。

3.重復(fù)步驟2 兩次。

4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過(guò)的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小時(shí)（溫度越低，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)）。

提示：強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間。因?yàn)榉趸臅r(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致很高的背景。

5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

              提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會(huì)降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。

6. 通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，如?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。

7.切斷二硫鍵

提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶應(yīng)確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個(gè)配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時(shí)或

者過(guò)夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時(shí)或者過(guò)夜孵

育，或者在98℃條件下5分鐘。