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多肽結(jié)合試劑盒（II）

運輸條件：室溫運輸

儲存：根據(jù)上表要求，在收到試劑盒時儲存各成分。

通過氨基以外的官能團固定親和配體，對實驗也是非常有幫助的。特別是使用硫醇基團，非常適用于引導特定蛋白質(zhì)分子上結(jié)合位點，或活性中心距離較遠的偶聯(lián)過程。使用獨特的活性基團進行定點固定，有利于正確定位，例如多肽中單個末端半胱氨酸上的巰基用于小抗原結(jié)合。

BcMag ? 多肽結(jié)合試劑盒旨在通過巰基（-SH）快速，高效和共價固定小分子多肽，用于親和純化操作。BcMag ?可切割的碘乙酰基活化磁珠被建議用于與小分子多肽結(jié)合，因為長臂親水接頭可以減少空間位阻。由于活化的碘代乙?；ㄟ^內(nèi)置的可裂解二硫鍵與充值連接（圖1），使用還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）可以裂解并將目標分子-配體復合物與磁珠分離，親和純化完成后只有一個巰基附著在配體上。

BcMag ? 可分離式碘代乙酰基活化磁珠（圖2）是均勻的二氧化硅基質(zhì)的超順磁珠，表面連接有高密度的碘乙酰基或可裂解的碘乙?；倌軋F。在堿性生理環(huán)境（pH 7.2--9）下，在含有20-30%DMSO或DMF的水性或有機溶劑中，碘代乙?；罨妮d體與巰基反應，產(chǎn)生穩(wěn)定的硫醚鍵。這些反應通常在黑暗環(huán)境下進行，以防止游離碘的形成，因為游離碘可與酪氨酸，組氨酸和色氨酸殘基反應。

工作流程

碘代乙?；胖樽鳛楣腆w載體可以完美地用于各種親和純化，將分子，細胞和部分細胞進行純化。只需要與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脫目標分子（圖3）

功能和優(yōu)點。

· 碘代乙酰基可與巰基（-SH）選擇性反應產(chǎn)生不可逆的硫醚鍵。

· 快速---在2小時內(nèi)快速結(jié)合多肽樣品。

· 適用于多種結(jié)合條件----根據(jù)偶聯(lián)反應期間蛋白質(zhì)或多肽溶解度的需要，在pH 7.5至9.0范圍內(nèi)，適用于水性緩沖液、有機溶劑（例如，20%DMSO）或變性劑（鹽酸胍）中使用。

· 樣品制備、固定和親和純化的操作方法非常簡單

· 高結(jié)合量----- 磁珠結(jié)合量可達到15-20μg抗體/mg磁珠。

應用領(lǐng)域：

· 用半胱氨酸殘基末端固定多肽，以純化針對肽免疫原產(chǎn)生的抗體。

· 使用鉸鏈區(qū)的巰基，以定向方式固定抗體，以確保在進行抗原親和純化時，抗原結(jié)合位點不會受到空間抑制。

· 生成可重復使用的免疫親和矩陣

· 維持抗體功能通過Fc區(qū)固定IgG，使兩個抗原結(jié)合位點均可用于靶標捕獲。

使用協(xié)議

注意：

§ 該協(xié)議可以根據(jù)需要擴大規(guī)模。我們強烈建議使用滴定法優(yōu)化每個實驗中使用的磁珠數(shù)量。.

所需材料

§ 結(jié)合緩沖液

1. 可溶性結(jié)聯(lián)緩沖液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5；

2. 不可溶性結(jié)聯(lián)緩沖液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5，20-30%DMSO或DMF或6 M胍?HCl

§ 清洗緩沖液： 1 M的氯化鈉（NaCl）溶解在蒸餾水中

§ L-半胱氨酸?HCl

§ TCEP（三(2-羰基乙基)磷酸鹽）

§ 磷酸鹽緩沖液（PBS）

§ BcMag^TM碘代乙酰基活化磁珠：用戶可以根據(jù)要求選擇不同的碘乙?；罨胖椋?/span>1μm BcMag? 長臂碘乙?；罨胖?，2.5μm 長臂碘乙?；罨胖?，5μm  BcMag? 長臂碘乙?；せ?，1μm BcMag? 可分離式碘乙?；罨胖?，或2.5μm BcMag? 可分離式碘乙酰基活化磁珠。

§ 磁力架

根據(jù)樣本量，用戶可以選擇以下磁力架之一：

1. BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

2.  BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

3. BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

4. BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

5. BcMag? separator-96可配套使用 96孔 ELISA板或者96孔PCR板 (Cat.# MS-05).

A．樣品準備

提示：

l 確保要結(jié)合的蛋白質(zhì)/肽含有游離（還原）巰基。為了確保還原巰基可用，必須用還原劑還原二硫鍵，如DTT（二硫蘇糖醇）、TCEP（三（2-羧乙基）膦）或2-MEA（2-巰基乙胺?HCl），然后脫鹽或透析以去除還原劑。

l 如果重組后立即使用，新合成的肽可直接用于偶聯(lián)

l 對于蛋白質(zhì)，在室溫下用5-10 mM TCEP溶液處理蛋白質(zhì)30分鐘，然后進行透析或脫鹽柱。對于IgG抗體，推薦使用2-MEA，因為它可以選擇性地減少鉸鏈區(qū)的二硫鍵。

l 如果樣品含有含有游離巰基的還原劑（如2-巰基乙醇、DTT或TCEP），則必須通過透析或脫鹽將這些還原劑完全去除。

1. 如果為可溶性蛋白，將1-10mg蛋白質(zhì)/肽溶解在1ml的soluble coupling buffer中。如果不溶，則溶解在1ml的Insoluble coupling buffer中。

2. 如果樣品已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，則用等量的結(jié)合緩沖液稀釋樣品。

B、 磁珠制備

1.  用100%丙酮（30 mg/ml）制備3%磁珠。

提示：將未使用的磁珠儲存在4℃的丙酮溶液中。可穩(wěn)定保存一年。

 2.  將100μl（3mg）磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。

3.   將試管放在磁力架上1-3分鐘。在試管保持留在磁力架上的同時，去除上清液。從磁力架上取下試管，并通過渦旋將磁子用1ml結(jié)聯(lián)緩沖液重懸30秒。

4.  重復步驟3兩次。

5.除去上清液，清洗后的磁珠已可以用于偶聯(lián)反應。

注意：使用偶聯(lián)緩沖液再水化后，由于官能團的穩(wěn)定性，請盡快使用磁珠。

C. 結(jié)合反應

1. 向清洗過的磁珠中加入100μl配體溶液，充分混合，并將樣品在室溫下于黑暗中孵育過夜，并充分混合。

2. 用1ml結(jié)合緩沖液清洗磁珠四次。

3. 阻斷磁珠上多余的活性基團，通過將磁珠懸浮在含有8mg L-Cysteine?HCl的1ml Coupling buffer中，并在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30-60分鐘。

4. 用1ml清洗緩沖液洗滌磁珠四次。

5. 將磁珠重懸于含有0.05%疊氮化鈉的PBS緩沖液中，并將其保存在4℃。

D、常見親和純化過程

提示：

l 該方案是一個通用的親和純化發(fā)法。因為沒有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計一個通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個用戶必須確定純化單個目標蛋白的最佳工作條件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。

l 強烈建議根據(jù)粗樣品中目標蛋白質(zhì)的含量，進行滴定，以優(yōu)化每個單獨實驗中使用的磁珠數(shù)量。使用過多的磁珠  

將導致較高的背景，而使用過少的磁珠將導致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通常可與1-20μg靶蛋白結(jié)合。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。

2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30

秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。

3.重復步驟2 兩次。

4. 向含有目標蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小時（溫度越低，培養(yǎng)時間越長）。

提示：強烈建議進行滴定實驗以優(yōu)化培養(yǎng)時間。因為孵化的時間太長可能會導致很高的背景。

5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

              提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。

6. 通過適當?shù)姆椒?，如?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標蛋白。

7.切斷二硫鍵

提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶應確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時或

者過夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時或者過夜孵

育，或者在98℃條件下5分鐘。