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高純度中量質(zhì)粒DNA純化試劑盒

快速中量質(zhì)粒DNA純化試劑盒，為分離高質(zhì)量質(zhì)粒DNA提供了一種快速，簡(jiǎn)便，可靠的方法。該試劑盒設(shè)計(jì)在20分鐘內(nèi)純化多達(dá)100μg的質(zhì)粒DNA，具有簡(jiǎn)單有效的方案，提取出適用于分子克隆或其他下游應(yīng)用的超純質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒是環(huán)狀的染色體外DNA分子，在分子生物學(xué)中充當(dāng)特定DNA片段的載體。再通過(guò)細(xì)菌來(lái)復(fù)制質(zhì)粒，從而可以大規(guī)模生產(chǎn)所需的DNA。研究人員從細(xì)菌中獲得質(zhì)粒的方法稱為質(zhì)粒提取。

從細(xì)菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA是克隆的關(guān)鍵步驟。細(xì)菌細(xì)胞在質(zhì)粒純化過(guò)程中被裂解，從而讓細(xì)胞中DNA和其他生物成分釋放出來(lái)。在去除掉大多數(shù)細(xì)胞成分后，將含有質(zhì)粒DNA與基因組DNA的DNA的裂解液進(jìn)行分離。

提取的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與通過(guò)兩次通過(guò)氯化銫梯度純化產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量相同，這是DNA純化最傳統(tǒng)的方法。高質(zhì)量的DNA可以在不到二十分鐘的時(shí)間內(nèi)被提取，用于轉(zhuǎn)染和其他應(yīng)用。不需要額外的過(guò)程來(lái)去除RNA，蛋白質(zhì)或內(nèi)毒素等雜質(zhì)。此外，《使用說(shuō)明》操作過(guò)程不需要使用苯酚、氯仿、溴化乙錠和氯化銫，減少了有害化合物的暴露和處置。

原理和工作流程（圖1）

BcMag ? 高純度中量質(zhì)粒DNA純化使用弱陰離子交換磁珠快速純化質(zhì)粒DNA。磁珠可以與質(zhì)粒DNA直接結(jié)合。這種方法使用傳統(tǒng)的細(xì)胞懸浮，堿性裂解和中和過(guò)程，并將質(zhì)粒DNA直接結(jié)合到磁珠上。再對(duì)磁珠進(jìn)行清洗去除雜質(zhì)，如RNA，蛋白質(zhì)，代謝物和其他低分子量分子。獨(dú)特的清洗緩沖液可確保消除無(wú)機(jī)鹽，蛋白質(zhì)，RNA和其他生物成分，從而獲得濃縮的高純度DNA。隨后用高鹽緩沖液洗脫高純度的質(zhì)粒DNA。再對(duì)DNA進(jìn)行脫鹽，用異丙醇沉淀洗脫的質(zhì)粒濃縮，然后離心。整個(gè)提取過(guò)程大約需要20分鐘才能完成。

功能和優(yōu)點(diǎn)

· 操作簡(jiǎn)單-不需要離心柱或過(guò)濾器。

· 快速-在不到二十分鐘的時(shí)間內(nèi)純化質(zhì)粒DNA。

· 無(wú)需苯酚/氯仿萃取

· 低內(nèi)毒素

· 高質(zhì)量-DNA適用于大多數(shù)下游應(yīng)用

· 可輕松調(diào)整提取樣本反應(yīng)體積，便于自動(dòng)化操作

· 可重復(fù)的結(jié)果

操作協(xié)議

所需材料

A. 緩沖液組成

· 所需材料：BcMag? 質(zhì)粒提取DNA磁珠。

· TE緩沖液：10mM Tris.HCL PH8  0.1mM EDTA

· 異丙醇（Sigma cat#19516）

· P1（重懸緩沖液）：50mM Tris.HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100ug/ml核糖核酸酶A（加入核糖核酸酶A后保存在4℃）

· P2（裂解緩沖液）：200mM NaOH，1%SDS（w/v）

· P3（中和緩沖液）：3.1M乙酸鉀，pH 5.5（保存在4°C）

· P4（平衡緩沖液）：750mM NaCl，50mM MOPS，pH 7.0，15%異丙醇（v/v），0.15%Triton X-100（v/v）

· P5（洗滌緩沖液）：1.0 M NaCl，50mM MOPS PH 7.0，15%異丙醇（v/v）

· P6（洗脫緩沖液）：2.5 M NaCl，50mM Tris.HCl，pH8.5，15%異丙醇（v/v）

B. 所需設(shè)備

a. 磁力分離器（手動(dòng)操作）

根據(jù)樣品體積，用戶可以選擇以下磁力架之一：

? BcMag? separator-2可以容納兩個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

· BcMag? separator-6可以容納六個(gè)單獨(dú)的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

· BcMag? separator-24可以容納24個(gè)單獨(dú)的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

· BcMag? separator-50可以容納一個(gè)單獨(dú)的50 ml離心管，一個(gè)15ml的離心管，以及四個(gè)1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

· BcMag 96-孔磁力分離器(單面) 可與96孔PCR板和96孔微孔板或其他型號(hào)離心板兼容使用 (Blioclone,  Cat#: MS-06)；

· 對(duì)于大規(guī)模凈化，陶瓷磁體塊用于大規(guī)模凈化（6英寸x 4英寸x 1英寸塊鐵氧體磁體，應(yīng)用磁體，Cat#Ceramic-B8）

b. 用于大規(guī)模純化的康寧430825細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Cole Parmer，Cat#EW-01936-22）

c. Mini BlotBoy 3D搖床，定速，小型10“x 7.5”平臺(tái)，帶平板墊（Benchmark Scientific，Inc.Cat#B3D1008）或同類(lèi)型產(chǎn)品

C. 操作過(guò)程

**該方案基于具有高拷貝質(zhì)粒的50 ml細(xì)菌培養(yǎng)物。然而，該方案可以根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)量適當(dāng)放大或縮小。

1. 細(xì)菌溶解

a. 將50ml過(guò)夜細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，以6000 rpm離心10分鐘，并除去上清液。

b. 用4ml P1緩沖液完全重懸細(xì)菌沉淀，輕輕加入4ml P2緩沖液混合，通過(guò)緩慢顛倒混勻在室溫下孵育5分鐘。

c. 加入4ml緩沖液P3，通過(guò)顛倒輕輕混合，在室溫下以12000-16000 rpm離心10分鐘，并小心轉(zhuǎn)移上清液。（如有必要，將上清液通過(guò)六層粗棉布過(guò)濾）至新鮮管中。

2. 質(zhì)粒純化

a. 震蕩試劑瓶，直到磁珠變得均勻，然后將1ml磁珠轉(zhuǎn)移到新的試管中。

注意：在分配之前，不要讓磁珠靜置超過(guò)3分鐘。每3分鐘重懸一次磁珠。

b. 將試管放在磁力架上1-3分鐘。當(dāng)樣品板保持在磁力分離器上時(shí)，將上清液去除。加入10倍磁珠體積的P4緩沖液，并通過(guò)移液或渦旋混合磁珠。再次將試管放在磁性支架上1-3分鐘，當(dāng)樣品板保持在磁力分離器上時(shí)，將上清液去除。

c. 將磁珠與細(xì)胞裂解液混合（step1c），在Mini BlotBoy 3D搖床上在室溫下連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育5-10分鐘，然后將試管放在磁力架上1分鐘，直到它變清澈，然后除去上清液。

d. 使用磁力架用6ml P5緩沖液清洗磁珠三次。

e. 向磁珠中加入1ml洗脫緩沖液，并通過(guò)上下移液15-20次完全重懸磁珠。將試管置于磁力架上1-3分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。

3. 質(zhì)粒沉淀

a. 加入700ul異丙醇，充分混合，在室溫下孵育2分鐘，并在室溫下以14000-16000 rpm離心10分鐘。

b. 小心地取出上清液，用600ul 70%乙醇洗滌沉淀，以14000-16000 rpm離心4分鐘，

c. 小心地取出上清液并將沉淀風(fēng)干5-10分鐘。（**不要過(guò)度干燥顆粒。否則顆粒很難分解）。

d. 用所需量的TE緩沖液重懸沉淀。（**在1%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行2-3 ul質(zhì)粒溶液以檢查質(zhì)量。如果存在RNA，則添加RNAse A以完全去除RNA）

質(zhì)粒純化常見(jiàn)問(wèn)題

你建議什么樣的培養(yǎng)條件？

培養(yǎng)物應(yīng)從單個(gè)菌落接種，并在適當(dāng)?shù)目股卮嬖谙略谂囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。從起始培養(yǎng)物中進(jìn)行亞培養(yǎng)也是可行的，但結(jié)果可能會(huì)有所不同。當(dāng)培養(yǎng)物從對(duì)數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，應(yīng)收獲細(xì)胞，以確保存在最大量的DNA而細(xì)胞裂解最少。單個(gè)菌落可用于接種在中高拷貝質(zhì)粒的正?？寺∵^(guò)程中，于37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)的5-10 ml培養(yǎng)物。1-3 ml的這種培養(yǎng)物應(yīng)該可以產(chǎn)生3-6μg的高拷貝質(zhì)?；?/span>1-2μg的中拷貝質(zhì)粒。較低拷貝的質(zhì)粒將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量，這可以通過(guò)處理較大的培養(yǎng)體積，同時(shí)縮放P1-B6緩沖液或濃縮純化的DNA來(lái)解決。

什么因素影響質(zhì)粒DNA的回收？

一些因素可以影響制備前和制備過(guò)程中的質(zhì)?；厥章?。質(zhì)?？截悢?shù)，質(zhì)粒大小，插入毒性，宿主菌株，抗生素選擇，生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以影響最終的質(zhì)?；厥章?。適當(dāng)時(shí)選擇高拷貝質(zhì)粒，并將總大小保持在10kb以下以獲得更高的產(chǎn)量。盡管產(chǎn)量較低，但可以分離出較大的質(zhì)粒（高達(dá)25 kb）。在生長(zhǎng)過(guò)程中保持抗生素選擇可確保質(zhì)粒不會(huì)丟失，并且培養(yǎng)物不會(huì)被沒(méi)有質(zhì)粒的快速增長(zhǎng)的細(xì)胞群淹沒(méi)。適當(dāng)?shù)耐夂蜕L(zhǎng)溫度確保對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞裂解很少。

利用低拷貝質(zhì)粒時(shí)應(yīng)該怎么做？

通過(guò)確保培養(yǎng)物在最佳通氣條件下培養(yǎng)并在主要細(xì)胞裂解發(fā)生之前除去，增加含有質(zhì)粒的完整細(xì)胞的數(shù)量。低拷貝質(zhì)粒的回收率總是低于高拷貝質(zhì)粒的回收率。使用更多的細(xì)胞可以彌補(bǔ)部分不足，但要遵循這些參數(shù)，以確保堿裂解是有效的，并且珠子不會(huì)被細(xì)胞成分淹沒(méi)。

你建議使用哪種文化媒體？

可以使用富媒體，例如2X YT或Terrific Broth。然而，它們通常在飽和時(shí)導(dǎo)致更大的細(xì)胞密度。因此，當(dāng)使用富培養(yǎng)基時(shí)，必須減少處理的培養(yǎng)物量，以避免由于生物量較大而導(dǎo)致的堿裂解不足和柱超載。我們建議在LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌。

你推薦哪種大腸桿菌菌株？

最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室克隆菌株可用作質(zhì)粒繁殖的宿主，用于miniprep純化。Thermofisher提供合適的菌株，例如DH5α（Thermo Scientific#18258012）或DH10B（Thermo Scientific#EC0113）。

質(zhì)粒是否用不含內(nèi)毒素的珠子回收？

盡管弱陰離子交換珠和緩沖液從樣品中去除了絕大多數(shù)內(nèi)毒素，但回收的DNA不能保證不含內(nèi)毒素。我們已經(jīng)成功地用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染了強(qiáng)大的細(xì)胞系。雖然一些制造商可能聲稱他們的minipreps試劑盒是“無(wú)內(nèi)毒素的”，但通常存在一些可定量的內(nèi)毒素。

質(zhì)粒miniprep后哪些因素影響my（A260/A280）？