產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
一步法 DNA 熒光染料清除試劑盒
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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AK101 |
BcMag? 一步法 DNA 熒光染料清除試劑盒 |
1 ml |
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AK102 |
BcMag? 一步法 DNA 熒光染料清除試劑盒 |
5 ml |
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"使用我們的一步法DNA熒光染料清除試劑盒可以從您的樣品中純化高品質(zhì)的熒光標記DNA。簡化的方案，可靠的結果和簡單的操作使其成為您標記DNA純化需求的完美選擇。
簡介
熒光染料，也稱為活性染料或熒光團，是一種天然或合成的化合物，可以吸收光并以更長的波長重新發(fā)光。由于熒光染料的多功能性、高靈敏度和定量能力等獨特優(yōu)勢，熒光染料被廣泛用于標記蛋白質(zhì)、抗體、多肽、配體、DNA和RNA等生物相關分子，用于細胞生物學、免疫學、生物化學、微生物學、分子生物學、基因組學和蛋白質(zhì)組學研究。熒光標記反應完后，通常需要從最終的共軛反應體系中去除多余或未反應的染料，因為它會干擾許多下游應用。去除熒光染料方法通常使用離心柱法、凝膠過濾法或重力流柱和透析法等方式來完成。然而，這些傳統(tǒng)方法存在許多問題，包括費時費力的操作過程，蛋白質(zhì)、多肽或核酸的回收率低，以及不適應自動化的程序。為此，我們研發(fā)出了一種新型的一分鐘脫色系統(tǒng)。
BcMag? 一步法 DNA 熒光染料清除試劑盒采用獨特設計和專利表面化學修飾的磁珠，專門去除生物分子標記反應中多余的游離（非共軛）熒光染料。本款磁珠操作方便僅需單步單管，完成凈化方案只需1分鐘，實際操作時間非常短（圖1）。本款磁珠可以在不到10分鐘的時間內(nèi)同時處理96個樣品。由于磁珠表明的磁性樹脂材料只吸附游離染料，標記的生物分子回收率極高且>90%。此外，如果使用適當?shù)臉悠妨亢途彌_條件，磁珠可以去除絕大部分染料(表1).。
表 1
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熒光染料 |
結合能力 ng /mg beads** |
熒光染料 |
結合能力 ng /mg beads** |
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Alexa Fluor 546 C5-Maleimide |
99.7 |
Alexa Fluor? 514 NHS Ester |
45.2 |
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Cyanine 3 carboxylic acid |
99.1 |
Cyanine 5 carboxylic acid |
49.7 |
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Cyanine 3 amine |
99.3 |
Cyanine 3.5 carboxylic acid |
99 |
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Cyanine 5.5 amine |
99.8 |
Cyanine 5.5 carboxylic acid |
99.7 |
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Cyanine 5 amine |
49.85 |
Sulfo-Cyanine 5.5 amine |
99.9 |
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Sulfo-Cyanine3 amine |
93.3 |
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid |
24.9 |
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DyLight? 488 NHS Ester |
90.5 |
DyLight? 633 NHS Ester |
87.4 |
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Dylight 680-4x PEG NHS Ester |
99.8 |
DyLight? 405 NHS Ester |
99 |
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Oregon Green? 488 carboxylic acid |
84.2 |
FAM amine, 5-isomer |
24.57 |
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Rhodamine 5B amine |
99.2 |
Texas Red? hydrazide |
890 |
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Cibarcron blue F3GA |
99.7 |
Fluorescein isothiocyanate |
120.3 |
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Bromocresol purple |
105.2 |
Phenol red |
99.5 |
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Denim red |
101 |
Bromophenol blue |
99 |
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Denim blue |
104.2 |
SYBR? dye |
102.4 |
**結合能力測定條件：在0.1M磷酸鈉、0.15M NaCl、pH7緩沖液中，將10μl磁珠（100 mg/ml）和100μl含有不同的染料濃度為50 ng-800 ng的蛋白質(zhì)樣品（1:400稀釋的人血清）混合。并以2000 rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘。染料去除率>93%，蛋白質(zhì)回收率>95%。
工作流程
使用程序非常簡單（圖1）。1.直接將磁珠添加到樣品中。2.用移液器吹吸或渦旋方式捕捉游離染料。3.磁珠從蛋白質(zhì)或DNA/RNA溶液中分離出來，而上清液中含有純化后的生物樣品。
優(yōu)勢及特點
l 簡單的操作過程：無液體轉(zhuǎn)移，僅需一管，一步操作，過程僅需1分鐘
l 方便快捷
l 結果真實可靠可重復性高：對于蛋白質(zhì)（>6 kDa，抑肽酶）或DNA/RNA（>25mer雙鏈DNA）樣品回收率>90%。
l 高效的清除效率：去除過量的引物（<100-mer ssDNA），二聚體，銜接子，無機鹽，如Mg2+，洗滌劑，dNTPs，酶和染料。
l 性價比高：無需離心柱、過濾器、不用反復的重復移液和使用有機試劑。
l 可用于高通量實驗：與許多不同的全自動核酸提取系統(tǒng)兼容。
操作協(xié)議
A. 用戶所需材料
· 18.2 MΩ.cm,無 DNase/Rnase超純水
· Triton? X-100, Sigma, Catalog # T8787
· 其他
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Item |
Source |
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磁力分離器
**根據(jù)樣品體積，用戶可以選擇以下磁力分離器之一 |
l BcMag? separator-2 適用于兩個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag? separator-6 適用于六個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag? separator-24 適用于24個單獨的1.5-2.0 ml離心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag? separator-50 適用于1個單獨的50毫升離心管，1個單獨的15毫升離心管, 以及4個 1.5毫升 離心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分離器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分離器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可調(diào)單通道和多通道移液器 |
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擺斗離心機 |
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如果使用96孔PCR板/管，則需要添加項目 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時間和速度應進行優(yōu)化，并且混合器應滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉(zhuǎn)速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf? MixMate? |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24?×?1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 離心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，確保PCR管或PCR板錐形部分底部的井徑必須≥2.5毫米。 |
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B.操作過程
重要提示：
1. 以下過程是經(jīng)過優(yōu)化的用于高效純化10μl DNA樣品。該實驗條件可以根據(jù)需要擴大或縮小實驗體積。如果應用于其他體積的反應條件，則需要對操作步驟進行優(yōu)化。
2. 使用前震動試劑瓶，使磁珠完全重新懸浮，直至均勻。
3. 在分液完成前，不要讓磁珠溶液靜置停留超過2分鐘。
4. 如果待純化反應溶液中含有超過0.5%的有機溶劑，例如待純化溶液中的DMSO（二甲基亞砜）含量，則用dH2O將有機溶劑濃度稀釋至0.2-0.5%（最終）范圍。
5、根據(jù)實驗要求，用戶可根據(jù)表2選擇緩沖條件。例如，如果樣品不含去垢劑，加入1ul的1%Triton? X-100溶液至10μL樣品中（則樣品中去垢劑終濃度為0.1%）。
6. 核酸定量：僅可使用熒光方法檢測，如qPCR、Qubit和Pico Green。
表2
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DNA 片段清除 |
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DNA |
+ 0.1% Triton x-100, pH7.5 |
- 0.1% Triton x-100 pH7.5 |
+ 0.1% Triton x-100 pH 8.0 |
- 0.1% Triton x-100 pH 8.0 |
+ 0.1% Triton x-100 pH 8.8 |
- 0.1% Triton x-100 pH 8.8 |
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dsDNA (100 bp) |
未清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (150 bp) |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (200 bp) |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
未清除 |
清除 |
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dsDNA (300 bp) |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
未清除 |
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ssDNA 100 mer |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
清除 |
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dsDNA- 雙鏈 DNA; ssDNA- 單鏈 DNA上 述驗證時通過下列條件完成的: 1. 10 mM Tris-HCl 含有或者不含有 0.1% triton (最終含量) 以及以下三個變量: pH 7.5, pH 8.0 和 pH 8.8 |
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1. 添加5ul磁珠產(chǎn)品到10ul的DNA待純化樣品中。
2. 如果需要，可短暫的2500rpm離心30秒，使所有成分都處于試管底部
3. 徹底混勻1分鐘，通過緩慢的使用移液器吹吸25次（一分鐘時間）；或者2500 rpm
渦旋震蕩5分鐘。
4. 如果需要，可短暫的2500rpm離心30秒，使所有成分都處于試管底部
5. 將裝有樣品的試管放入磁力分離器中30秒，直到磁珠徹底被吸附到試管底部，上清
液變澄清為止。
6. 將試管保持在磁力分離器中，同時，將上清液轉(zhuǎn)移到一個干凈的試管當中，用于下
游實驗。
C.故障排除
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DNA回收率低 |
渦旋時間太長 或者渦旋速度太快 |
· 減少渦旋時間或者速度 · 如果使用其他型號的渦旋混勻器，則渦旋時間和速度需要重新優(yōu)化 |
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磁珠使用過多 |
徹底的懸浮磁珠，并準確的加入磁珠的用量 |
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DNA回收率低 |
樣品緩沖液未優(yōu)化 |
· 如果樣品中不含有去垢劑，向樣品中添加曲通拉X-100（最終濃度為0.1%） |
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雜質(zhì)去除失敗 |
PCR 管或者PCR 板型號不對 |
確保PCR 管或者PCR 板的底部圓錐形截面直徑≥2.5mm. |
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渦旋的速度太慢或者渦旋時間太短 |
· 增加渦旋的速度或者渦旋時間 · 如果使用其他型號的渦旋混勻器，則渦旋時間和速度需要重新優(yōu)化. |
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磁珠使用量太少 |
徹底的懸浮磁珠，并準確的加入磁珠的用量 |
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DNA片段有較強的二級結構 (<50bp dsDNA or < 100 mer ssDNA) |
通過95°C加熱2分鐘使樣品變性 |
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有太多的引物，二聚體，銜接體，游離染料或者去垢劑 |
· 增加磁珠使用量 · 進行第二次純化，按照相同的純化過程 |
